細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）

 GK4003-10

 GK4003-20

GK4003-50

 GK4003-100

一. 試劑盒組成

*Proteinase K使用前，每管参加1 ml 無菌水溶解，混勻，分裝後-20℃生存。

(a) Digestion Solution低溫時可能出現結晶，請于37℃溫育溶解搖勻後使用，不會影響産率。

(b) 首次使用前，必須在AW1溶液瓶中按体现量参加無水乙醇，充实混勻後使用。每次使用後將瓶蓋蓋緊，以保持中的AW1乙醇含量。如果您發現AW1由于運輸或保管不當造成容量嚴重禁绝，請用量筒定容後再参加0.6倍體積的無水乙醇。

(c) 首次使用前，必須在AW2瓶中参加4倍體積的無水乙醇，充实混勻後使用。每次使用後將瓶蓋蓋緊，以保持AW2中的乙醇含量。如果您發現AW2由于運輸或保管不當造成容量嚴重禁绝，請用量筒定容後再参加4倍體積的無水乙醇。

(d) AE Buffer爲10 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA pH 8.5pH8.5。TE(pH 8.0)大概水（pH>7.0）均可以使用，但是DNA的洗脫效率通常要低20%左右。

(f)不得將Proteinase K直接加到Digestion Solution中，以免酶失活。

(g) Lysozyme使用前参加按5 mg溶于100?l計算，溶于SP Buffer，溶解後，分裝于-20℃凍存。

客戶自備：PBS緩沖液，胰卵白酶，無水乙醇 

運輸 儲存溫度

運輸  室溫

儲存   Proteinase K  , Lysozyme ,  Boiled RNase A   : -20℃

        其他  室溫

二. 主要用途

從細菌和各種培養細胞中小規模抽提基因組DNA。

三. 主要特點

1.離心吸附柱內矽基質膜全部接纳進口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，重複性好。

2.不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沈澱等步驟。

3.快速，簡捷，單個樣品操纵一般可在50分鍾內完成。

4.多次柱漂洗確保提取細菌基因組的高純度，OD_260/280nm典范的比值達1.7～1.9，長度可達50～100kb，可直接用于PCR， Southern-blot和各種酶切反應。

四. 培養細胞與細菌樣品准備

1．培養細胞的准備

(1) 對于懸浮培養细胞： 1,000g室溫离心5分鍾，徹底去除上清。

(2) 對于单层培養细胞：吸去培養基，用PBS洗涤细胞，然後用胰卵白酶消化细胞。当细胞从培養瓶外貌脱落以後，將细胞转移到离心管中，1,000g室溫离心5分鍾，徹底去上清。

(3) 將離心去上清的細胞用150?l TE(pH8.0)懸浮。

處理細胞可達1×10⁶～5×10⁷個，增加處理細胞數量，請相應增加處理時間。

2．細菌樣品的准備

(1) 將適量的指數生長期細菌（最多可達5×10⁸細菌，約0.5 ml留宿培養菌液），8,000rpm，離心1分鍾，徹底弃净培養基。

(2) 加入150?l TE(pH8.0)懸浮細菌，凭据下表中的要求参加Lysozyme溶液，用吸頭混勻，對于革兰氏阳性和革蘭氏陰性菌酶解时间的要求是不一样的，详见下表。

革蘭氏陰、陽性菌所用溶菌酶濃度與酶解時間表

五. 操纵步驟

1. 在按准備要领制備的150?l TE懸浮樣品中，参加300?l Digestion Solution，混勻；参加4?l RNase A混勻，55℃保溫10分鍾；再参加4?l Proteinase K， 55℃保溫10～30分鍾。

注意：(1)应按序次参加，不得將Proteinase K先参加Digestion Solution，再加到樣品中。

(2)保溫时间取决于樣品的类型。對于细胞樣品，55℃保溫10分鍾足以使细胞裂解，暑^懦龌蚪MDNA。降解完全的樣品應是透明液體。

2. 如獲得的裂解液粘稠度較低，則直接添加300?l PB Solution，充实搖動混勻，12,000rpm室溫离心5分鍾，將上清全部轉移到套放于2ml收集管內的GenClean柱中。

注意：(1) 如獲得的裂解液過于粘稠，則依次添加300?l  Ext Solution以及300μl PB solution充实搖勻，12,000rpm室溫离心5分鍾，上层溶液爲蓝色，基因組DNA存在于下層溶液中，兩層中間可能會有一些沈澱物。然後用1ml Tip頭伸到下層，將下層溶液全部轉移到套放于2ml收集管內的GenClean柱中，注意盡量不要吸到上層溶液和中間層沈澱。

(2) 参加Ext和PB溶液後，一定要用力充实搖勻，不然背面离心时杂质不容易分层。

3. 8,000rpm室溫离心1分鍾。取下GenClean柱，棄去收集管中的廢液。

4. 將GenClean柱放接纳集管中，参加500?l Wash Solution，8,000rpm，室溫离心1分鍾。取下GenClean柱，棄去收集管中的廢液。

5. 重複步驟4一次。

6. 將GenClean柱放接纳集管中，12,000rpm，室溫离心1分鍾，以去除殘留的Wash Solution。

注意：此步调高速空离是爲了去尽殘留的乙醇，请勿省略，不然可能因所纯化的核酸中殘留有乙醇而影响后续的实验效果。

7. 將GenClean柱放入新的潔淨的1.5ml離心管中，在GenClean柱中央参加50～100?l Elution Buffer，室溫或37℃安排2分鍾。

注意：(1)爲提高洗脱效率，可以將Elution Buffer預熱到55～80℃。

(2) 如果樣品中基因組DNA含量很低，用30?l Elution Buffer洗脱可以提高洗脱液的樣品濃度，但产率有所下降。

8. 12,000rpm，室溫离心1分鍾。离心管中的液体即爲基因組DNA。根據用途，樣品可以4℃或-20℃生存。

注：重複步驟7～8，將洗脱液再次参加到吸附膜上，重新洗一次，可以提高産率10%～20%。

9. 用分光光度計測量DNA含量按1OD₂₆₀=50?g/ml基因組DNA定量並標記。進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳判定樣品DNA的完整性和是否有RNA。本試劑盒抽提的DNA長度可達100kb以上。

六．儲存

常温儲存一年。

七．問答

Q-1 基因組DNA得率低或无基因組DNA

A-1一般情況下，從100?l-1ml留宿培養的大肠杆菌中，可以提取1-10?g的基因組DNA，推薦的菌液量是用500?l的留宿培養的浓菌液。我们不发起用过多的菌液，可能导致溶液不敷而低落所提DNA的质量。基因組DNA得率較低時可從一下幾個方面考慮：

1.DNA未充实暑^牛茉TE中充实懸浮菌体，注意不要殘留菌体，参加Digestion Solution充实混勻。

2.溶菌酶失活，溶菌酶要用附帶的SP  buffer配制，用水或堿性的TE配置的溶菌酶不能长期生存。配制好的溶菌酶最好分裝成小份于-20℃生存。

3.Proteinase K失活，proteinase K起到酶解細菌的作用，该酶失活后細菌裂解效率將大大低落。

4.洗脱时將灭菌水或Elution Buffer 加熱至65℃后使用將有利于提高洗脱效率。

5.嚴格凭据操纵要领進行操纵有利于提高基因組DNA得率。

Q-2提取的基因組DNA有降解，爲什么？

A-2 1.确认选用的培養菌体是否新鲜，如果菌体需要生存时，请于-80℃生存

    2.起始菌液量過多，導致菌液裂解不充实，部分DNA降解。

3.菌體自己富含DNA酶活性，参加Digestion solution後再補加20ul 0.5M EDTA溶液來抑制內源性核酸酶。

Q-3 提取的DNA中有RNA污染，爲什么？

A-3 1.一般提取基因組DNA過程中，RNA殘留已经很少了，如果需要淘汰提取DNA中的RNA的含量，有须要在消化步驟中参加4?l RNase A。

    2. RNase A可能失活。RNase A一般比較穩定，不易失活。如果確認是RNase A長期生存等原因導致其活性喪失，可以用實驗室中已有的RNase A替代試劑盒中的RNase A。

Q-4 提取的基因組DNA生物活性差，爲什么？

A-4 1. 提取的基因組DNA中盐分濃度过高，请严格凭据说明书操纵。

2. 提取的基因組DNA中含有乙醇。離心的速度和時間應該嚴格遵循說明書要求進行。

Q-5 能否用本试剂盒提取酵母中的基因組DNA？

A-5 不能，酵母属于真核生物，其细胞壁的化学组成和结构与細菌差别，因此Lysozyme不能使其細胞壁溶解，所以，本試劑盒不能提取酵母中的基因組DNA。如果需要提取酵母基因組DNA，請用酵母提取試劑盒。

Q-6 本试剂盒是否适用于任何菌体基因組DNA的提取？

A-6 不一定。有些細菌的细胞壁的结构比力特殊，使用Lysozyme进行溶菌，其基因組DNA不能有效的暑^懦隼础１热Staphylococcus Aureus 等革蘭氏陽性菌便无法使用本试剂盒提取基因組DNA。

Product Use Limitation:

This product is developed, designed and sold exclusively for research purpose and in vitro use only.